“”是英文单词“bioinformatics”的中文译名，其概念是1956年在美国田纳西州gatlinburg召开的“生物学中的信息理论”讨论会上首次被提出的［1］，由美国学者lim在1991年发表的文章中首次使用。生物信息学自产生以来，大致经历了前基因组时代、基因组时代和后基因组时代三个发展阶段［2］。2003年4月14日，美国人类基因组研究项目首席科学家collins f博士在华盛顿隆重宣布人类基因组计划（human genome project，hgp）的所有目标全部实现［3］。这标志着后基因组时代（post genome era，pge）的来临，是生命科学史中又一个里程碑。生物信息学作为21世纪生物技术的核心，已经成为现代生命科学研究中重要的组成部分。研究基因、蛋白质和生命，其研究成果必将深刻地影响农业。本文重点阐述生物信息学在农业模式植物、种质资源优化、农药的设计开发、作物遗传育种、生态环境改善等方面的最新。
1.生物信息学在农业模式植物研究领域中的应用
1997年5月美国启动国家植物基因组计划（npgi），旨在绘出包括玉米、大豆、小麦、大麦、高粱、水稻、棉花、西红柿和松树等十多种具有经济价值的关键植物的基因图谱。国家植物基因组计划是与人类基因组工程（hgp）并行的庞大工程［4］。近年来，通过各国科学家的通力合作，植物基因组研究取得了重大进展，拟南芥、水稻等模式植物已完成了全基因组测序。人们可以使用生物信息学的方法系统地研究这些重要农作物的基因表达、蛋白质互作、蛋白质和核酸的定位、代谢物及其调节网络等，从而从分子水平上了解细胞的结构和功能［5］。目前已经建立的农作物生物信息学数据库研究平台有植物转录本（ta）集合数据库tigr、植物核酸序列数据库plantgdb、研究玉米遗传学和基因组学的mazegdb数据库、研究草类和水稻的gramene数据库、研究马铃薯的pomamo数据库，等等。
2.生物信息学在种质资源保存研究领域中的应用
种质资源是农业生产的重要资源，它包括许多农艺性状（如抗病、产量、品质、环境适应性基因等）的等位基因。植物种质资源库是指以植物种质资源为保护对象的保存设施。至1996年，全世界已建成了1300余座植物种质资源库，在我国也已建成30多座作物种质资源库。种质入库保存类型也从单一的种子形式，发展到营养器官、细胞和组织，甚至dna片段等多种形式。保护的物种也从有性繁殖植物扩展到无性繁殖植物及顽拗型种子植物等［6］。近年来，人们越来越多地应用各种分子标记来鉴定种质资源。例如微卫星、aflp、ssap、rbip和snp等。由于对种质资源进行分子标记产生了大量的数据，因此需要建立生物信息学数据库和采用分析工具来实现对这些数据的查询、统计和计算机分析等［7］。
3.生物信息学在农药设计开发研究领域中的应用
传统的药物研制主要是从大量的天然产物、合成化合物，以及矿物中进行筛选，得到一个可供临床使用的药物要耗费大量的时间与金钱。生物信息学在药物研发中的意义在于找到病理过程中关键性的分子靶标、阐明其结构和功能关系，从而指导设计能激活或阻断生物大分子发挥其生物功能的治疗性药物，使药物研发之路从过去的偶然和盲目中找到正确的研发方向。生物信息学为药物研发提供了新的手段［8，9］，导致了药物研发模式的改变［10］。目前，生物信息学促进农药研制已有许多成功的例子。itzstein等设计出两种具有与唾液酸酶结合化合物：4-氨基-neu5ac2en和4-胍基-neu5ac2en。其中，后者是前者与唾液酸酶的结合活性的250倍［11］。目前，这两种新药已经进入临床试验阶段。tang sy等学者研制出新一代抗aids药物saquinavir［12］。pungpo等已经设计出几种新型高效的抗hiv-1型药物［13］。杨华铮等人设计合成了十多类数百个除草化合物，经生物活性测定，部分化合物的活性已超过商品化光合作用抑制剂的水平［14］。
现代农药的研发已离不开生物信息技术的参与，随着生物信息学技术的进一步完善和发展，将会大大降低药物研发的成本，提高研发的质量和效率。
4.生物学信息学在作物遗传育种研究领域中的应用
随着主要农作物遗传图谱精确度的提高，以及特定性状相关分子基础的进一步阐明，人们可以利用生物信息学的方法，先从模式生物中寻找可能的相关基因，然后在作物中找到相应的基因及其位点。农作物的遗
传学和分子生物学的研究积累了大量的基因序列、分子标记、图谱和功能方面的数据，可通过建立生物信息学数据库来整合这些数据，从而比较和分析来自不同基因组的基因序列、功能和遗传图谱位置［15］。在此基础上，育种学家就可以应用计算机模型来提出预测假设，从多种复杂的等位基因组合中建立自己所需要的表型，然后从大量遗传标记中筛选到理想的组合，从而培育出新的优良农作物品种。
5.生物信息学在生态环境平衡研究领域中的应用
在生态系统中，基因流从根本上影响能量流和物质流的循环和运转，是生态平衡稳定的根本因素。生物信息学在环境领域主要应用在控制环境污染方面，主要通过数学与计算机的运用构建遗传工程特效菌株，以降解目标基因及其目标污染物为切入点，通过降解污染物的分子遗传物质核酸 dna，以及生物大分子蛋白质酶，达到催化目标污染物的降解，从而维护空气［16］、水源、土地等生态环境的安全。
美国农业研究中心（ars） 的农药特性信息数据库（ppd） 提供 334 种正在广泛使用的杀虫剂信息，涉及它们在环境中转运和降解途径的16种最重要的物化特性。日本丰桥技术大学（toyohashi university of technology） 多环芳烃危险性有机污染物的物化特性、色谱、紫外光谱的谱线图。美国环保局综合风险信息系统数据库（iris） 涉及 600种化学污染物，列出了污染物的毒性与风险评价参数，以及分子遗传毒性参数［17］。除此之外，生物信息学在生物防治［18］中也起到了重要的作用。网络的普及，情报、信息等学科的资源共享，势必会创造出一个环境微生物技术信息的高速发展趋势。
6.生物信息学在食品安全研究领域中的应用
食品在加工制作和存储过程中各种细菌数量发生变化，传统检测方法是进行生化鉴定，但所需时间较长，不能满足检验检疫部门的要求，运用生物信息学方法获得各种致病菌的核酸序列，并对这些序列进行比对，筛选出用于检测的引物和探针，进而运用pcr法［19］、rt-pcr法、荧光rt-pcr法、多重pcr［20］和多重荧光定量pcr等技术，可快速准确地检测出细菌及病毒。此外，对电阻抗、放射测量、elisa法、生物传感器、基因芯片等［21-25］技术也是未来食品病毒检测的发展方向。
转基因食品检测是通过设计特异性的引物对食品样品的dna提取物进行扩增，从而判断样品中是否含有外源性基因片段［26］。通过对转基因农产品数据库信息的及时更新，可准确了解各国新出现和新批准的转基因农产品，便于查找其插入的外源基因片段，以便及时对检验方法进行修改。目前由于某些通过食品传播的病毒具有变异特性，以及检测方法的不完善等因素影响，生物信息学在食品领域的应用还比较有限，但随着食品安全检测数据库的不断完善，相信相关的生物信息学技术将在食品领域发挥越来越重要的作用。 。。
参考文献：
［1］yockey hp，platzman rp，quastler h.symposium on information.theory in biology.pergamon press，new york，london，1958.
［2］郑国清，张瑞玲.生物信息学的形成与发展［j］.河南农业科学，2002，（11）：4-7.
［3］骆建新，郑崛村，马用信等.人类基因组计划与后基因组时代.中国生物工程杂志，2003，23，（11）：87-94.
［4］曹学军.基因研究的又一壮举——美国国家植物基因组计划［j］.国外科技动态，2001，1：24-25.
［5］michael b.genomics and plantcells：application ofgenomics strategies to arabidopsis cellbiology［j］.philostransr soc lond b bio sci，2002，357（1422）：731-736.
［6］卢新雄.植物种质资源库的设计与建设要求［j］.植物学通报，2006，23，（1）：119-125.
［7］guy d，noel e，mike a.using bioinformatics to analyse germplasm collections ［j］.spri
nger netherlands，2004：39-54.
［8］郑衍，王非.药物生物信息学，化学化工出版社，2004.1：214-215.
［9］俞庆森，邱建卫，胡艾希.药物设计.化学化工出版社，2005.1：160-1.
［10］austen m，dohrmann c.phenotype—first screening for the identification of novel drug targets.drug discov today，2005，10，（4）：275-282.
［11］arun agrawal，ashwini chhatre.state involvement and forest cogovernance：evidence from the indianhmi alayas.stcomp international developmen.t sep 2007：67-86.
［12］tang sy.institutionsand collective action：self-governance in irrigation ［m］.san francisco，ca：icspress，1999.
［13］pungpo p，saparpakorn p，wolschann p，et a.l computer-aided moleculardesign of highly potenthiv-1 rt inhibitors：3d qsar and moleculardocking studies of efavirenz derivatives［j］.sar qsar environres，2006，17，（4）：353-370.
［14］杨华铮，刘华银，邹小毛等.计算机辅助设计与合成除草剂的研究［j］.计算机与应用化学，1999，16，（5）：400.
［15］vassilev d，leunissen j，atanassov a.application of bioinformatics in plant breeding［j］.biotechnology & biotechnological equipment，2005，3：139-152.
［16］王春华，谢小保，曾海燕等.深圳市空气微生物污染状况监测分析［j］.微生物学杂志，2008，28，（4）：93-97.
［17］程树培，严峻，郝春博等.环境生物技术信息学进展［j］.环境污染治理技术与设备，2002，3，（11）：92-94.
［18］史应武，娄恺，李春.植物内生菌在生物防治中的应用［j］.微生物学杂志，2009，29，（6）：61-.
［19］赵玉玲，张天生，张巧艳.pcr 法快速检测肉食品污染沙门菌的实验研究［j］.微生物学杂志，2010，30，（3）：103-105.
［20］徐义刚，崔丽春，李苏龙等.多重pcr方法快速检测4种主要致腹泻性大肠埃希菌［j］.微生物学杂志，2010，30，（3） ：25-29.
［21］索标，汪月霞，艾志录.食源性致病菌多重分子生物学检测技术研究进展［j］.微生物学杂志，2010，30，（6）：71-75
［22］朱晓娥，袁耿彪.基因芯片技术在基因突变诊断中的应用及其前景［j］.重庆医学，2010，（22）：3128-3131.
［23］陈彦闯，辛明秀.用于分析微生物种类组成的微生物生态学研究方法［j］.微生物学杂志，2009，29，（4）：79-83.
［24］王大勇，方振东，谢朝新等.食源性致病菌快速检测技术研究进展［j］.微生物学杂志，2009，29，（5）：67-72.
2009年，卫生部立项“十二五”八年制规划教材《生物信息学》的编写工作，并将生物信息学列为八年制医学生的必修课。这是中国现代医学教育的一件大事，一方面体现国家对高等医学人才全面发展、提高理工科理论水平的重视程度；另一方面也表明生物信息学理论已经深入到生物医学科研和实际应用层面，理论生物医学研究已经被国内院校所接受，成为生物医学学科群的重要组成部分[1]。
生物信息学是一门新兴的交叉学科，有非常明显的理工科特性，即在有良好的生物医学背景下，注重数学思维和计算机操作能力，这对于我们目前以医学专业学习为主的高等医学教育产生一定的挑战。如何在有限的学时基础上，完成生物信息学教学任务的同时，让学生初步掌握科研、临床中应用生物信息学的能力，形成理工科处理医学问题的思维，是目前在八年制学生中开展生物信息学教学迫切需要研讨的问题。笔者作为主讲教师于哈尔滨医科大学完成了两轮八年制生物信息学教学任务，通过教学过程、课后调研及考试分析，总结了八年制学生对学习生物信息学的一些认识和学习期间遇到的问题，在这里共同探讨，以便于推进医学院校生物信息学的教学工作，培养更高理论和实践层次的医学人才。
一、授课对象
课程面向临床医学八年制学生93人、基础医学八年制（基地班）学生60人，学生入学录取分数高于生源地重本线50分以上。开课时两个专业的学生均处于大学三年级，已经学完高数、计算机基础等理工基础课，分子生物、细胞生物等生物学基础课，以及组胚、生理等医学基础课，开课学期同时学习遗传、免疫、病理和药理学课程；部分学生参加PBL教学，已经完成呼吸、消化、循环系统的知识学习。
二、教材和课程内容选择
面向两个轨道分别开展《医学信息分析方法》（36学时）和《生物信息学概论》（56学时）两门课程。两个轨道均以人民卫生出版社规划教材《生物信息学》2010年第一版为主讲教材[2]，结合临床医学和基础医学的学科特点，采取教师自主选择内容的方式讲授。
在临床专业中以疾病理论和分析方法为中心，专题式讲解疾病分析相关资源、研究策略和常用软件工具。36学时的《医学信息分析方法》讲授疾病数据资源和系统理论、遗传多态与疾病定位、转录信息学与复杂疾病分析、miRNA表达与疾病分类、疾病状态表观遗传改变，及测序技术与疾病研究进展等6个专题。每个专题包括4学时理论课程和2学时上机实践。。
在基础专业中强调生物医学研究数据资源、计算生物医学方法和实验设计手段，系统讲解生物信息学在生物医学研究中的理论和实践技术。讲授内容涉及序列数据资源与分析方法、分子进化、基因表达与、蛋白质组学信息学、网络系统生物学、遗传和表观遗传计算分析、疾病的计算系统生物学等较全面的生物信息学方法和理论，要求学生能够在生物医学研究中贯穿理工科分析思维，不仅能熟练运用相应的网络资源和软件工具，还能对生物信息学方法理论有一定了解，熟悉不同方法的扩展性应用。理论和实践课基本按照2比1分配，实践课程根据内容需要选取生物学或医学问题进行全程模拟实验。
三、考试形式和分析
现阶段，两个八年制专业的生物信息学教学以必修考查课形式进行，采取开卷考试、实验报告和标书设计三种考核方式，以便于了解学生对本门课程的学习和对生物信息学研究思想的领悟情况。
开卷考试试题均为主观题，其中理论基础题考查概念、重要的研究思路和经典的研究方法；；思维拓展题给定学生主题词，由学生进行以生物信息学方法为工具的课题流程设计。考试结果表明学生能够通过学习了解基本的生物信息学方法，并具备初步运用新方法解决实际问题的能力，但考试也反映出，大学三年级学生还具有一定的科研思维局限性，不能够完全把握课题设计过程的创新性和可靠性原则。
实践能力考查主要通过实验报告进行，实验报告要写明研究问题名称、实验数据、处理方法、处理结果和结果分析讨论。通过实验报告的提交，学生基本能够就相应的问题自主选择数据、进行一般性软件分析，并能够对实验结果进行知识面内的讨论和思考，得出符合问题要求的结论。
标书设计作为课后实践，要求学生就自己感兴趣的研究方向进行课题设计。设计内容可以为生物信息学方法研究，也可以以生物信息学为工具进行生物医学问题的探讨和分析。大多数学生能够通过文献查阅、原先具备的生物医学知识总结，发现有意义的生物医学问题，设计内容具有现实意义和一定创新性的，部分课题还有较好的可行性。很多标书设计也暴露出在三年级开展生物信息学时，学生的临床医学知识还比较欠缺，有时候不能很好的发现具有医学意义或应用价值的课题，也比较难于理解生物信息学在实际应用中的价值。
四、学生反馈和教学心得
通过课堂互动、课程临近结束时进行的问卷调查，笔者进一步了解了学生在生物信息学学习过程中的一些困惑，及一些意见和建议。主要问题如下：
1、课程理论性强，计算强度大
学生们普遍反映生物信息学与他们学习的其他课程不一样，生物医学课程偏向于文科性质，主要靠记忆，而生物信息学理科特性很强，需要深入理解分析。另外学生的数理知识有限，感到有些算法比较难，根本听不懂。
2、课程内容多，课时少
许多学生通过学习对生物信息学产生了浓厚的兴趣，真切感受到生物信息学对于他们未来的学习、科研和临床工作将有很大帮助，但是课时太少，不能够在现有课时下理解全部理论。
3、实践课时少，计算机能力薄弱
绝大多数学生都认为生物信息学需要通过理论结合实践的方法来学习才能更好的掌握。现有的实践课程只能完成基本的教学任务，对于众多的研究工具和研究方法只有感性认识。另外大家在实践中也感觉到自身的计算机知识很有限，在高通量数据处理面前力不从心，影响对问题的分析能力。
4、课程开课偏早，背景知识不全
很多学生反映三年级时，八年制学生还没有进行统计学、临床各学科的培养，知识背景不足，很难理解生物信息学中重要的算法公式，也很难对医学问题进行更为深入的思考。
学生们的反馈基本上反映出他们在学习生物信息学时所遇到的困难。笔者所在教研室教师（包括多名规划教材的参编者）共同进行了深入探讨，认为应当根据学生意愿向学校申请①增加理论课课时，分别由24和36增加为28和44学时；②增加实践课课时，分别由12和20增加20和28学时；③适当降低理论难度，减少不必要的数学理论推导，提请学校为八年制学生增设概率统计和计算机编程课程。
生物信息学的理工科特性决定了生物信息学课程在医学教育中开展的难度。虽然医学院校学生课业重、训练强度大，但是现代生物医学发展趋势告诉我们，生物信息学必然在未来的生物医学研究中处于关键地位[3]。。
参考文献
[1] Wei Liping and Yu Jun; Bioinformatics in China: A Personal Perspective [J]; Plos Computational Biology， 2008， 4(4): e1000020.
关键词：生物信息学；合作式教学；教学模式；教学改革
。（浙江 临安 311300）
基金项目：本文系浙江农林大学“农学类核心课程教学团队”项目（项目编号：TD1201）、浙江农林大学研究生优质课程建设项目《生物信息学》的研究成果。
中图分类号：G2.0 文献标识码：A 文章编号：1007-0079（2013）16-0110-02
生物信息学是20世纪90年代由多学科知识相互渗透、融合而兴起的一门新兴交叉学科，现已成为当今生命科学和自然科学的重大前沿领域之一。[1]基于本学科在现代生命科学研究中的重要地位，现在国内外许多高校都纷纷设置了生物信息学专业或开设了“生物信息学”课程。[2]为培养具有创新精神和创业能力的应用型、复合型人才，浙江农林大学近年来面向农学等本科专业及作物、森林培育、林木遗传育种等研究生专业开设了“生物信息学”选修课程。
生物信息学是理论概念与实践应用并重的学科，具有开放性、发展性、交叉性、综合性、应用性等特点。鉴于此，尽管国内的生物信息学科学研究开展得如火如荼，但由于受到师资、教材、授课对象、教学条件、教学法等因素，[3，4]开设该课程的高校尚未真正形成一套成熟的、科学的教学体系。近年来，各高校根据自身特点，不断探索将CM法、PBL法、探究性、启发性教学、双语教学等教学法与手段引入课堂，并革新教学内容及考核方式等，取得了不错的课程教学效果。[3，5-9]
现代教学改革与实践证明，在教学过程中必须要突出“学生是教学活动的主体”，既要注意张扬学生“个性”，更要强化学生团队合作意识及创新、创业能力培养，以保证人才培养质量。杨瑞等[10]调查发现，现在大部分学生比较“独”，不愿意与人合作，这导致学生间人际关系淡漠，学习、做事效率低下。随着各种“组学”计划的开展，产生了数以万、亿计的序列数据，生物信息学得到了空前发展。在这种情况下，传统的“填鸭式”、“布道式”教学模式已与当前社会快速发展的局面格格不入，迫切需要变革。合作式教学法是20世纪70年代兴起于美国的一种参与式或协作式教学法，它以学生为中心，在教师恰当的组织、引导和有效下，使学生成为教学过程中的积极成分，通过“师生”、“生生”积极合作完成教学任务。[11]为激发学生的学习积极性和教学参与热情，在采用启发式、案例式和研讨式教学基础上，尝试将合作式教学法引入“生物信息学”教学课堂。
一、开展合作式教学的必要性
“团结就是力量“、“独学而无友，则孤陋而寡闻”、“三人行必有吾师”等至理名言很好地阐释了团队合作的重要性与必要性。浙江农林大学于2008年开始在农学、种子科学与工程等专业开设“生物信息学”课程。农学是生命科学领域的重要学科之一，基因组学和生物信息学的发展极大地促进了农学等生物科学研究的进步。因此，系统学习并掌握生物信息学的基本知识、基本理论和基本技能，不仅是学校培养“两创型”高素质农业科技人才的需要，也是国家发展现代高新农业对农学相关专业学生的基本要求。
一是学生的重视程度不够。有些学生对该课程的认识比较偏颇，不清楚其教学目的及学后有何用处，因而学习目的不明确，学习动力不足。
二是学生的知识水平参差不齐。。因此，采用教师讲授、预设问题，学生提问，学生组队分析和解决问题，教师点评加总结等“师与生”、“生与生”合作式教学，不仅可以使学生明晰本课程的学习目的，增强他们的参与意识与学习热情，更重要的是，可以使学生之间优势互补、互通有无、集思广益，达到“以活动促合作，以合作促发展”的目的。
二、合作式教学的组织与实施
1.教学目标与设计
（1）教学目标。根据现代教育教学规律，以“生物信息学”优质课程建设为依托，以课堂建设为抓手，以培养“两创型”高素质应用人才为根本任务，以多媒体、网络、教学平台为载体，深化改革，通过师生、生生间相互影响与合作，突显学生教学主体地位，切实提高课堂教学效果。
（2）教学设计。因为“生物信息学”课程涉及的知识点比较多，而课时有限，所以正规的合作式教学法即小讲课加分组活动不太适合。根据“生物信息学”课程性质及农学相关专业学生的学习特点，本课程采用在教师教学过程中加入合作式教学法元素的形式进行教学。教学过程中，避免过多讲授数据库开发、软件算法等纯理论性内容，坚持以解决生物学问题为主线，讲授解决问题的思路与方法；坚持以教师为主导，以学生为主体，结合教师自身科研工作及本学科领域最新研究进展等案例教学，组织、引导和启发学生开展自主与合作学习，培养学生思考、分析问题和解决问题的能力及团队合作精神与创造力。
2.教学组织与实施
合作式教学的关键是调动学生学习兴趣，使其积极参与其中，即教师应用灵活多样的教学手段，鼓励学生积极参与教学过程，并通过实践演练、课堂报告、研讨、课上和课下实时交流等为载体强化教学效果。
（1）实例为导，强化练习。在讲授完每个知识点后，教师结合自己的科研工作在网络上进行案例示范演示，然后由学生两两临时搭配组队上台操作，完成规定任务，巩固所学知识。比如在讲解完“用关键词或词组检索生物信息学数据库”后，在2个自然班中分别临时组建4个两人小组，每个小组中一人负责出题，另一人负责解题，然后负责出题的学生对解题过程及答案进行点评，最后其他同学和教师进行点评及总结，加深了学生对相关知识点的理解。
（2）预设问题，开放教学。在讲授新的知识点前，教师预先设置知识点相关问题，让学生课后自学和探究思考，期间学生之间讨论，亦可请教教师。比如在讲到系统进化部分时，布置思考题“有哪些证据证明人类是从非洲走出来的？”或者教师预设一些本学科热点问题或尚未解决的问题（无固定答案），让学生自由组队，通过课下查阅相关文献资料、思考及组内成员讨论等探讨相关问题的解题思路与方法，从而激发学生学习热情。比如“蛋白质和DNA的进化问题，是先有‘鸡’还是先有‘蛋’？”“除了农学及医学外，生物信息学还有哪些应用领域？”等等。学生带着问题去查找资料，通过集体讨论达成共识。在各小组汇报时，首先由组内成员做补充说明，然后由其他组同学进行质疑。在相互质疑、讨论中，使学生获取灵感，扩大视野。
（3）角色互换，学生提问。改变过去教师“一言堂”教学局面，鼓励学生随时就相关问题进行提问，由学生或教师解答，真正做到师生互动，启发学生思考，活跃课堂气氛。
。因为本学科知识点间连贯性较强，所以在讲授2-3个知识点后，教师要布置综合性的题目，由学生组队在网络实验室里现场完成教学任务。学生组队是半自由型的，即教师提出一定要求，在此前提下学生组队，以避免“优优”或“差差”组合等情况发生，使学生间做到优势互补，且既有分工，又有合作。比如，在讲完系统进化树重构章节后，要求学生根据研究兴趣每5人一组，完成同源基因的搜集、多序列比对、系统进化树构建、分析及解读等所有环节，然后各小组进行课堂报告。学生组队必须满足教师提出的要求，即成员必须分别来自不同的自然班且成员间学习成绩差异要比较明显；成员中最好有英语、计算机或生物学成绩较好的学生；成员间必须有分工，分别负责查资料、制作PPT、汇报等，且又必须通力合作，共同完成任务等，从而激发学生的创新思维和创新意识，增强学生的团队合作意识与协作能力。
（5）全员参与，分类评价。本课程为专业选修课。课程成绩以平时成绩70%，期末考试（开卷）30%来计算。平时成绩主要由学生出勤、课堂参与度、实验报告、课堂报告等组成，其中实验及课堂报告环节均以小组形式进行，重点考查学生的学习态度和完成质量等。在涉及到分组考核时，要求小组间分别评分，教师采取一定措施保证各组间打分相对客观、公平，实现全员参与评价。
（6）实时沟通，解惑释疑。。教师可据此及时调整授课方案，达到更好的教学效果。
3.教学效果与评价
经在2010级2个自然班55名农学专业学生中进行合作式教学试点发现，学生最终成绩中最低72分，最高95分，平均为86.1±5.08分。经T检验分析，显著高于27名2008级学生的平均成绩（83.2±5.13分；p=0.023）。因此，在“生物信息学”课程开展以课堂活动为特征的合作式教学，不仅活跃了课堂气氛，增强了学生的参与意识，还极大地调动了学生主动学习的积极性，明显提高了学习成绩，培养了学生的科研创新能力和团队合作意识。“教学结合实际”、“讲课时经常会举些有关知识的例子，很能提高同学的学习热情”、“老师时常会讲授有关的科学前沿知识，很能调动同学积极性”、“注重培养学生自主学习能力”、“上课与其他老师的方式不一样，利于我们听课”、“始终让我保持上课兴趣”、“上课有活力！”等是学生对“生物信息学”课程教学模式与教学效果的客观评价。
三、结束语
生物信息学是一个不断发展中的学科。实践证明，只有紧跟学科发展步伐，及时更新、丰富教学内容；坚持“以生为本”，立足授课对象的实际需要，不断调整和革新教学模式与教学方法，改进和完善学科教学体系，才能稳步提升本课程课堂教学效果，保证教学质量，从而为我国农业现代化培养更多高素质、强能力的应用型人才。
参考文献：
[1]张阳德.生物信息学[M].北京：科学出版社，2009.
[2]程钢.生物信息学课程教学改革和实践[J].安徽农学通报，
2011，17（13）：191-193.
[3]张纪阳，刘伟，谢红卫.生物信息学课程研究性教学的实践与思考[J].高等教育研究学报，2011，34（4）：51-53.
[4]梁琛，张建海.农科类生物信息学课程教学中存在的问题及对策[J].农业与技术，2010，30（5）：136-138.
[5]，柴慧.CM教学法和PBL教学法的结合应用研究——以医学生物信息学为平台[J].中国高等医学教育，2012，（8）：116-117.
[6]郭艳芳，李金明.PBL教学法在医学生物信息学实践教学中的应用[J].基础医学教育，2011，13（11）：1007-1008.
[7]刘伟，张纪阳.“生物信息学”课程中研讨式教学实践[J].中国电力教育，2012，（23）：60-61.
[8]魏战勇，高晓平.农业院校生物信息学教学改革与探索[J].郑州牧业工程高等专科学校学报，2011，31（4）：50-51.
[9]胡娜，常军，徐玲.生物信息学教学改革与实践[J].安徽农业科学，2010，38（3）：1588-15.
关键词：计算系统生物学；教学；医学院校；课程
生命系统高度复杂,成千上万的基因相互作用,形成复杂的网络,继而完成特定的生物学过程。传统生物学实验从单个基因角度出发,探索生命现象或者疾病致病机制,忽略了系统中各个层面的交互、支持、整合等作用,了生物学研究的发展。随着高通量测序技术的发展,海量组学数据(基因组、转录组、蛋白质组、表观组、互作组等)的涌现,以及生物信息整合分析技术的开发,计算系统生物学应运而生[1]。计算系统生物学是生物信息专业本科生基础课程。自哈尔滨医科大学2003年开设生物信息专业以来,计算系统生物学一直是该专业学生的主干课程,经过多年的理论与实践教学,笔者将探讨该课程相关内容和教学方法,以期提高教学质量。
1计算系统生物学课程简介
计算系统生物学是一门新学科,以生物信息学为基础,以计算为工具,从系统的角度解决生物学和医学问题。计算系统生物学研究流程首先是实验数据的获得,其次是利用计算生物学建立生物模型。科学家把计算系统生物学分为“湿”的实验部分(实验室内的研究)和“干”的实验部分(计算机模拟和理论分析)。“干”和“湿”实验的完美整合才是真正的计算系统生物学[2]。计算系统生物学的核心是整合,包括三方面：将系统内不同性质的构成要素(基因、mRNA、蛋白质、生物小分子等)整合在一起进行研究；从基因到细胞、到组织、到个体的各个层次的整合；研究思路和方法的整合(水平型和垂直型整合)。计算系统生物学与其他学科密切相关,如生物信息学、分子生物学、数学、计算机[3]。计算系统生物学不仅仅渗透到医药领域,也已经广泛应用到能源领域,工业生产、畜牧农林业等等。
2教学现状
计算系统生物学课程总学时数目是60学时,包括42学时理论学时和18学时实验学时。一般开设在本科三年级。该课程授课教师质量优,是从生物信息学方向毕业的博士,具有生物背景和数学背景,常年从事复杂疾病的系统生物学方面的研究。由于该课程在医学院校开设,必然需要一些具备计算机和算法良好基础的优秀教师参与授课,这样才能使得该课程具有良好的师资结构,保证好的授课效果。目前,据不完全统计,全国有30余家生物信息学专业开设计算系统生物学课程。不同背景的院校开设该课程,侧重点各有不同。工科院校侧重算法的开发和模型的建立。医学院校侧重生物学问题和疾病机制的探索。
3教学内容
目前没有规范的、成熟的中文计算系统生物学课程教材,均是授课教师编写的讲义。授课教师根据专业背景、专业人才培养定位,紧跟专业前沿研究内容,制定教学大纲和教学计划,包括理论课和实验课。教学大纲包括理论课每一个学时的授课内容(掌握和熟悉的内容)、教学基本要求、教学重点和难点。实验课需要明确实验名称、实验内容、实验目的和要求、实验程序、结果分析等。计算系统生物学的实验制定以理论为基础,将理论应用于时间,旨在提高学生动手操作能力。
4教学模式
4.1理论与实践结合
计算系统生物学课程依赖于专业基础课的内容,例如:组学的知识点、网络知识点、概率论、数理统计、计算机编程等。对于理论课,主要采用教师主导的传统讲授方法,运用PPT等多媒体授课,以弥补书本教材抽象、呆板的缺点。。。从数据搜集、数据分析、数据综合、建立模型、干实验模拟、系统分析模型、提炼假设和预测,到最后的实验验证。这是一个经典的计算系统生物学分析流程。在理论知识的基础上,需要及时在实验课堂上进行实践。指导学生理解不同算法的基本原理,结合生物学问题,深入浅出地阐明计算系统生物学精髓。由于实验课课时有限,需要引导学生课后积极思考、探索有意思的生物问题,鼓励学生自己实践小课题,活学活用。。
4.2案例式授课
计算系统生物学课程的理论知识是枯燥的,计算系统生物学是一门多学科交叉的科学,涉及的知识面广而深。例如:计算系统生物学涉及到数学知识,如贪婪算法、图算法、组合模式匹配、聚类和树、隐马氏模型、随机化算法等[4]。又如,涉及广泛的生物学知识点,必须有分子生物学、生物化学、细胞生物学知识储备。如何提高学生学习的积极性,学会将不同的知识点融会贯通的运用起来,是一个关键问题。在授课过程中,针对不同的教学内容和教学目的,需要采取不同的教学方法。因此,采取案例式方法授课,可以收到很好的教学效果。例如:在肿瘤系统生物学这部分知识点授课时,以肺癌为例,整合突变、拷贝数、甲基化等度分子改变识别肺癌相关基因[5]。首先,学生需要了解肺癌这个疾病的背景知识,了解不同分子改变的内涵；其次,要获得肺癌患者的数据,需要到公共数据库,如TheCancerGenomeAtlas等,搜集不同分子改变数据并进行处理；然后,根据一定的生物学假设,建立统计模型,应用到肺癌数据上；最后,进行癌基因的预测和验证。通过案例,引导学生思考,将不同的知识点进行融合利用,收到良好的教学效果。
4.3科研教学一体化
计算系统生物学是一门新学科,知识处于不断更新中。教师在授课过程中需要引导学生学会检索文献、阅读前沿英文文献,重视学生的创新思维,提高学生学习的积极性。我院实行学业导师制,学生在大三年级进入各位老师研究的课题组。那么,在授课过程中,授课教师需要注重引导学生将理论知识应用到解决科研问题上,将科学研究和教学一体化,以科研促进教学,学以致用,让学生感受到学到的知识的用处。这样学生对课程内容会产生兴趣,兴趣是最好的老师,这将有助于学生创新思维的训练和科研时间能力的培养。
5结语
总之,计算系统生物学教学目的是从大数据中挖掘有用的生物信息,并整合起来从整体上认识生物系统；用数学模型为生物系统建模,揭示生物机制和致病机制[6]。大数据时代下,精准医学的发展必然离不开计算系统生物学。通过该课程的授课,培养复合型的学生,提高学生的学习积极性、实践操作能力和解决实际问题的创新能力。同时,对我们任课教师也提出了更高的要求。授课教师需要不断提高自身素质,包括科研能力、教学水平等,积极和同专业的教师进行交流,不断地探索和完善计算系统生物学课程教学,培养具有跨越数理科学、生命科学、信息科学、医学等不同领域的优秀生物信息学人才。
参考文献
[1]妍妍,蔡超钱,蒋华良,等.计算系统生物学：理论、方法及在药物研发中的应用[J].生命科学,2010(10)：1035-1042.
[2]程妍,刘仲林.计算生物学一门充满活力的新兴交叉学科[J].科学学与科学技术管理,2006(3):11-15.
[3]高亚梅,韩毅强.《生物信息学》本科教学初探[J].生物信息学,2007(1):46-48.
[4]王兵,姚益平,邢飞.计算系统生物学中并行随机仿真方法研究进展[J].计算机工程与科学,2010,32(9):134-139.
[5]张百红,岳红云.肿瘤的系统生物学观点[J].中国肿瘤临床,2012(16):1233-1235.
无
(i0002)沉痛悼念乔群教授 无
(i0003)中华医学会整形外科分会血管瘤与脉管畸形专业组第一次学术交流会会议纪要 胡晓洁 江成鸿 林晓曦
无
临床论著
(401)乳腺癌保乳术后腹腔镜带蒂网膜瓣一期乳房重建术 宋向阳 管丹丹 林辉 戴益 郑雪咏 朱一平 王先法
(405)重度褥疮的临床治疗经验 许喜生 马铮铮 周永生 欧才生 程勇 陈凯 李柏同 周海洋 胡永才
(411)咪喹莫特治疗婴幼儿血管瘤 马刚 林晓曦 江成鸿 陈辉 李伟 胡晓洁 金云波 陈达 陈晓东 叶肖肖
(415)小儿颈部巨大囊状淋巴管瘤的手术治疗 刘大看 马玉春 郭晓楠 朱晓爽 董长宪
(417)本刊对论文中实验动物描述的要求 无
临床论著
(418)游离胫后动脉穿支皮瓣修复手、足背皮肤缺损 赵风景 张兴群 姚建民 马亮 张龙春 陈莹
(421)改良vechitti阴道成形与腹膜阴道成形术的对比研究 董丽霞 陈树波
(424)型尿道上裂的解剖学修复 李养群 潘焕丽 唐勇 陈文 赵穆欣 杨喆 刘晓吉 胡春梅 刘媛媛 马宁 谢淼
(427)悬韧带松解延长术后延长长度预测模型的建立和验证 王洪一 陶灵 陈亮 曹川 李世荣
实验论著
(431)p57^kip2和maspin在病理性瘢痕组织中的表达 蔡玉梅 朱世泽 郑志芳 杨维群 吴文艺
(437)饲服环磷酰胺对兔耳早期增生性瘢痕组织的影响 邵家松 孟德峰 岳毅刚 周海 花鸣春 张敏
(442)血管内皮干细胞动员剂对糖尿病小鼠颅骨缺损愈合的影响 王晓霞 stephen warren
(448)四氯二苯二噁英致胎鼠腭裂作用机制的初步探讨 蒲亚兰 刘丽玲 甘立强 何晓梦 傅跃先
生物信息学
(453)基于文献挖掘的增生性瘢痕相关基因的生物信息学分析 黄琛 李博仑 秦泽莲
工作研究
(461)胸大肌后与腺体后隆乳术后患者损伤情况比较 郭科 孙家明 苏永胜
(462)奈福泮与曲马多预防整形手术腰麻-硬膜外联合麻醉寒战的效果比较 张治明 欧阳帆 王剑鸣 赵振龙 张安生
经验介绍
(4)邻指指动脉岛状皮瓣修复手指皮肤软组织缺损 侯桥 曾林如 王
利祥 许良 吴国明 朱芳兵
(465)先天性狭窄及闭锁八例手术治疗体会 胡春梅 李养群 唐勇 杨喆 赵穆欣 刘媛媛 陈文 马宁
技术改进
(467)介绍一种微创无菌快速获取可移植脂肪颗粒装置 黄海玲 刘宏伟 佘文莉 徐媛 陈苑雯 谢波 肖丽玲
(468)薄膜涂色法在扩张皮肤面积测量中的评价 谭子明 沈为民 彭旦生
病例报告
(470)会阴严重烧伤患者再造一例 朱小平 包国宏 黄朝帅
(471)足拇趾离断再植及踝前穿支皮瓣修复成功一例 储国平 吕国忠 赵庆国 杨敏烈
综述
关键词：蛋白质-蛋白质对接；分子动力学模拟；蛋白质-蛋白质相互作用
Abstract：Proteins that play a critical role in many cellular processes often perform their functions by interacting with other proteins. Therefore， the studies of protein-protein interactions are vital to exploring the essence of life， understanding the mechanism of diseases and developing new drugs to improve human health. With the sustained development of bioinformatics， more and more computational methods have been applied to structural and functional research of proteins. Protein-protein docking and molecular dynamics simulation are both widely applied to the studies of protein-protein interactions. This article reviews the theory of computational methods， softwares and the application in protein-protein interactions.
Key words：Protein-protein docking； Molecular dynamics simulation； Protein-protein interactions
众所周知，蛋白质在生物进程中扮演着重要的角色。蛋白质通过与其他生物大分子（如蛋白质，DNA和RNA）相互作用介导细胞内各种重要的生理过程，如基因的复制、转录、翻译以及细胞周期、信号转导、免疫反应等，其中，蛋白质-蛋白质相互作用尤为常见。因此蛋白质-蛋白质相互作用的研究有助于人们探明其细胞内功能，从而了解各种疾病发生机制，为进一步的新药研发提供帮助。目前为止，研究蛋白质-蛋白质相互作用主要有酵母双杂交、免疫共沉淀、亲和色谱、质谱、核磁共振等多种实验方法，这些技术为蛋白质相互作用研究做出了重要贡献，积累了宝贵的数据资源。
随着计算机处理能力的不断提升，生物信息学的理论模拟方法得到迅速发展和广泛应用。生物信息学整合数学，物理，化学，信息学等众多学科的优势，以计算模拟手段进行生物学相关研究。自Janin和同事们[1]首次运用自动化对接算法预测牛胰蛋白酶抑制剂-胰蛋白酶复合物3D结构至今，蛋白质-蛋白质对接领域已取得很大进步。该方法常用于蛋白质结构及功能研究，分析配体与蛋白质间或者蛋白质-蛋白质间的相互作用模式，便于研究者从原子水平探究受体-配体间作用机制。分子动力学模拟在诞生至今的几十年中不断随着计算机软硬件技术的快速提升而愈加发展完善，已经成为研究蛋白质、核酸等生物大分子的结构和动力学特性的重要工具。本文将对蛋白质-蛋白质对接和分子动力学模拟的基本原理及其在蛋白质间相互作用研究中的应用进行简要概述。
1 蛋白质-蛋白质对接
准确的蛋白质-蛋白质复合物结构是进行蛋白质-蛋白质相互作用研究的基础。然而，通过实验方法测定蛋白质-蛋白质复合物结构比测定单个蛋白质更加困难。随着计算机水平的不断发展，人们开始希望用计算模拟手段来预测蛋白质复合物的真实结构，并希望从原子层面来分析蛋白质-蛋白质相互作用的内部机制。蛋白质-蛋白质分子对接是一种常用的方法。它是指利用两个单体蛋白质的三维空间结构，来预测蛋白质-蛋白质复合物结构。解决蛋白质对接问题有两个关键因素：打分函数和搜索算法[2]。打分函数应能够区分出正确的或近似正确的蛋白质对接复合物，而且搜索算法需严格地探索由相互作用的蛋白质形成的巨大构象空间。
1.1打分函数 蛋白质-蛋白质对接可以被归类为一个全局最优化问题，其主要目的是找到蛋白质分子间最稳定关联结构。使用打分函数是准确评估结合蛋白间的相互作用所必需的。打分函数有两个作用：构象采集和母板选择及精制。打分函数的根本目的是从错误的对接取向中区分出正确或近似正确的对接取向。打分函数主要有两种类型：基于物理原理的函数和基于实验知识的函数。通常，基于物理原理的能量函数用分子力场如CHARMM[3]和AMBER[4]描述蛋白质-蛋白质相互作用。
打分函数可能包括几何学与化学的互补，静电力、范德华力和氢键的相互作用以及解相关能量项。最常用的打分函数是形状互补。经常将形状互补与FFT算法联合应用于详尽的全局搜索。静电场在带电粒子或极性分子间的相互作用中扮演着重要角色。泊松-玻尔兹曼方程常被用来解决从原子水平获得溶剂化生物分子系统的静电电位问题。打分函数包括了极其重要的离散和核心相互作用，通常用范德华力相互作用来描述。
1.2搜索算法 搜索算法的主要目的就是在势能图上定位最稳定的状态。对接复合物可能解的构象搜索可通过两种不同的方案执行。第一种方案是进行全空间搜索，第二种是随机地或按一定顺序只搜索局部空间。快速傅里叶变换是最为著名的用于全空间的搜索算法之一。Katchalski-Katzi[5]和助手首次将快速傅里叶变换法用于蛋白质对接，确定受体配体间几何契合。该方法被应用于许多程序，如GRAMM[6]， FTDock[7]，3D-Dock[8]以及ZDock[9]。局部搜索算法包括模拟退火，蒙特卡洛法及遗传算法等。Vieth和助手们[10]发现分子动力学法最适于进行大空间搜索，而遗传算法比其他算法更适合进行小空间搜索。大多数情况下，蒙特卡洛算法和分子动力学算法都用来进行蛋白质柔性处理。
1.3对接过程 蛋白质-蛋白质对接一般通用的过程包括：①尽可能多的从全局或局部搜索中生成对接复合物；②筛选和评估复合物；③精制和重排。这三步可被细分为更多步。第一步完成刚体的全局搜索，尽可能多的生成对接蛋白质-蛋白质构象。在第二步中，采用生物或实验信息和打分函数来扫描并评估第一步得到的对接复合物。错误对接复合物的得分比接近X射线结构复合物的得分高是很常见的，许多得分高的结构并不实际存在。应过滤掉这些不实际存在的结构，将剩下的对接复合物进行评估。第三步涉及到侧链及可能骨架的柔性。柔性处理时主要进行重排侧链。
2 分子动力学模拟
分子动力学模拟是一门利用经典力学来模拟大分子体系运动的方法，它综合了数学、统计物理、化学、计算机等多门学科的内容。分子力场是分子动力学模拟的基础。它采用简单的函数来描述分子能量与结构之间的关系。分子力场的基本函数形式包括了原子之间的成键相互作用与非键相互作用。非键相互作用主要包含了范德华力与长程静电力。
2.1分子动力学模拟过程 分子动力学模拟的步骤主要包括了四步：第一步是确定初始构象，初始构象尽量选越接近模拟系统的结构越好，通常是能量较低的构象。通常采用分子力学方法对其构象进行优化；第二步平衡相过程，在前一步中已经确定的模拟体系将进行平衡相过程。在构建平衡相的过程中，须对其构象以及温度等参数进行并加以监控，还要判断体系是否已经达到平衡；第三步生产相过程，模拟体系中的分子以及构成分子的原子开始根据初始速度运动，此时根据牛顿力学和预先给定的粒子间相互作用势来对各个粒子的运动轨迹进行计算，并从这个过程中抽取计算分析时所需要的数据和样本；第四步将对计算结果进行深入分析处理。
2.2研究进展及常用软件 Tajkhorshid等成功的模拟了水分子通过不同通道亚型的过程[11]。Xu等在水溶液和磷脂双层中对β淀粉样多肽进行了多次长时间分子动力学模拟，发现在生物膜和有机溶剂中以α螺旋为主，在水溶液中则以无规则卷曲为主[12]。京都大学医学研究科的岩田想[13]成功分析了存在于细胞的，负责将物质运送到细胞内的一种蛋白Mhp1的构造，运用该结果通过在计算机上模拟，在分子层次上弄清了Mhp1将物质运往细胞内的机制。
目前，用于分子动力学模拟的软件越来越成熟。较为常用的主要有：GROMACS，NAMD， AMBER，CHARMM，TINKER、LAMMPS等。GROMACS[14]是用户界面友好的分子动力学模拟软件，模拟中的参数条件和基本功能已经趋于成熟，里面包含多种力场，非常适用于模拟生物大分子这种复杂体系。同时由于其速度快，在非生物体系统中也得到了广泛的应用。AMBER[15]不仅是一个程序，而是包含了从体系准备到动力学模拟，再到轨迹分析等一系列程序的集合。同时，AMBER 还是一系列力场的名称，这些力场涵盖了蛋白质、核酸、糖类、脂类等众多生物大分子。NAMD同样适用于模拟计算蛋白质、核酸等生物大分子体系，而且并行计算效率非常高。
3 展望
目前，蛋白质分子对接及分子动力学模拟等计算手段虽然已广泛用于蛋白质-蛋白质间相互作用的相关研究，但还是存在一些值得改进的地方。例如，蛋白质-蛋白质对接过程中，蛋白质柔性的相关处理，构象搜索的合理性及打分函数的准确度；分子动力学模拟中力场的种类和所研究体系的匹配度等。随着计算机技术不断的发展，这些生物信息学方法有待进一步优化和相关软件需要进一步完善，从而使其更适用于蛋白质等生物大分子的模拟研究。总之，将生物信息学方法与传统实验手段相结合来进行蛋白质间相互作用等生物大分子体系研究，是一条有待进一步发展的有效途径。
参考文献：
[1]WodakS J，puter analysis of protein-protein interaction[J].Journal of molecular biology，1978，124：323-342.
[2]Taylor，J.S.and Burnett，RM.DARWIN：A program for docking flexible molecules[J].Proteins. 2000，41：173-191.
[3]Brooks，B.R.，States，D.J.， S.andKarplus，M.CHARMM： a program for macromolecular energy， minimization， and dynamics calculations[J]put.Chem.1983，4： 87-217.
[4]Ferguson， D.M.， Kollman，P.A.A second generation force field for the simulation of proteins， nucleic acids， and organic molecules[J]. J. Am. Chem. Soc，1995， 117： 5179-5197.
[5]Katchalski，Vakser，I.A.Molecular surface recognition： determination of geometric fit between proteins and their ligands by correlation techniques[J].Proc.Nat.Acad.Sci.USA，1992.： 2195-2199.
[6]Tovchigrechko， Vakser， I.A.Development and Testing of an Automated Approach to Protein Docking[J].Proteins，2005，60：296-301.
[7]Gabb，H.A.，Sternberg，M.J.E.Modeling protein docking using shape complementarity， electrostatics and biochemical information[J].JMB.1997，272：106-120.
[8]Moont， Sternberg，M.J.E.Modelling protein-protein and protein-DNA docking[J].In Bioinformatics - From Genomes to Drugs，2001，1：361-404.
[9]Chen， R.and Weng，Z.A novel shape complementarity scoring function for protein-protein docking[J].Proteins，2003，51：397-408.
[10]Vieth， M.， Hirst.Assessing search strategies for flexible docking[J]put.Chem，1998，19： 1623-1631.
[11]Tajkhorshid，E， Schulten， K.，Control of the selectivity of the aquaporin water channel family by global orientational tuning[J]. Science， 2002， 296： 525-530.
[12]Xu ，Y.，Jiang， H.Conformational transition of amyloid beta-peptide[J].PNAS.USA，2005，102： 5403-5407.
[13]Shima mura，T.，Beckstein. Molecular basis of alternating access membrane transport by the sodium-hydantoin transporter Mhp1[J].Science.2010，328：470-473.
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容
Copyright © 2019- wisdomgame.cn 版权所有
违法及侵权请联系：TEL:199 18 7713 E-MAIL:2724546146@qq.com
本站由北京市万商天勤律师事务所王兴未律师提供法律服务